罗氏诊断KAPA EvoPlus Kit助力实现样本打断自动化
转自罗氏诊断生命科学公众号
随着NGS检测的临床有效性不断地被验证，实验室检测的样本量逐渐地增多，实现NGS复杂流程在工作站上自动化是大势所趋。但是，在开放式的工作站上，客户如何实现样本打断自动化，一直没有很好的解决方案。
通常，NGS建库使用的打断方法不外乎下面两种，各有优势又各有缺点。
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一种是基于超声波的物理打断方法或称为机械打断。这种方法需要专门的设备和耗材，以Covaris的设备为代表。物理打断有其独特的优势，比如说样本断点的随机性高，不会有位点的偏好，也不会受样本纯度的影响。然而物理打断的设备和耗材成本很高，并且难以在工作站中整合超声设备实现自动化。通常情况下物理打断法处理一个样本需要平均3-5分钟的时间，因此一旦样本数量变多，它就变成一个操作单一同时又极度耗时的方法。
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另一种是基于酶切打断的方法，包括转座子或各种混合水解酶等对DNA进行化学切断。酶切的方法不需要特殊的设备，只需要普通的PCR仪，可以批量的处理样本并轻松在工作站上实现自动化。同时酶切较物理打断的DNA损耗更小，文库转化效率更高，对于一些珍贵的样本，文库构建的 更好。但是，目前的酶切试剂盒存在或多或少的数据偏好性。除此之外，酶切建库试剂盒构建的文库会有一定比例的假阳性嵌合，特别是做一些基因融合检测的应用时会干扰检测结果的判读。
虽然这些假阳性干扰可以通过数据分析进行过滤，但这对生信人员提出了更高的要求且带来了更多的工作量。同时，酶切对于样本会有比较高的要求，比如样本的纯度(特别是EDTA的含量）和样本的降解程度，都会对酶切的效果产生诸多的影响。这使得实验室对于不同来源或不同类型的样本需要设置不同的SOP。对实验室技术人员和管理人员都造成了一定的困扰。
如何整合物理打断和酶切打断的优势，解决这些实现自动化的障碍？
答案是：
罗氏诊断KAPA EvoPlus Kit上市了！✦
KAPA EvoPlus 主要解决了以下4个问题：
1.EDTA敏感性导致的酶切产物大小不稳定性
图1 100ng gDNA,37℃ 25 min 打断，
KAPA UDI接头，8循环扩增
（图片来源：罗氏诊断整理）
对含有不同EDTA浓度缓冲液的DNA进行相同条件的打断和建库，可以看到文库的大小都符合预期。
2.数据假阳性
图2 与物理打断的建库试剂盒（KAPA HyperPrep）进行比较，
可以看到EvoPlus已经将假阳性的比例降至同一水平。
（图片来源：罗氏诊断整理）
图3 经内部测试，与国内外市场上同类型酶切建库试剂盒
进行平行比较，Evoplus的假阳性比例 低。
（图片来源：罗氏诊断整理）
3.工作站移液步骤过多，试剂包装对自动化不兼容
KAPA EvoPlus简化了实验流程，减少了移液步骤以降低交叉污染的风险，预混液及96孔板式包装更匹配自动化工作站，另有管式包装可供手动建库用户选择。
图4 打断、末端修复和加A尾整合成一步反应，预混液包装
无需进行反应体系配制，简化实验操作流程。
（图片来源：罗氏诊断整理）
4.实验流程长，试剂稳定性差，在工作站上难以长时间存放而无法实现全流程无人值守
KAPA EvoPlus即便是ReadyMix预混液包装，依然能长期稳定保存，试剂盒效期18个月。
图5 经内部测试，打断试剂在室温5周之后
依然可以保持相当的打断效果。
（图片来源：罗氏诊断整理）
*仅用于科学研究，不用于临床诊断。MC-CN-01945有效期至2025年1月26日
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