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reads千万条,接头是一条

转自罗氏诊断生命科学公众号
 

接头连接是二代测序文库制备的重要环节,接头连接效率是影响文库质量和产量的重要指标之一,它直接影响文库的多样性以及低频突变检测的准确性。随着测序仪的不断迭代,接头设计也在不断升级,种类更加多样化。

 

 

接头结构

接头作为文库的组成部分,以illumina接头为例,一般包括P5/P7、Index以及R1 SP/R2 SP序列,长约60bp左右(不同种类的接头长度有所不同)。其中P5/P7序列与测序芯片上的P5/P7序列互补,通过锚定将待测片段固定在flow cells上进行桥式PCR扩增;Index又称为样本标签,目的是给文库加上特定的标签,用于文库混合测序时区分不同的文库样本;R1 SP/R2 SP是Read1和Read2测序引物结合的区域,在dNTP和DNA聚合酶的作用下进行碱基延伸。接头的一般结构,呈“Y”字型。

 

 

 

 

接头种类

罗氏测序样本制备解决方案提供兼容illumina仪器的全套KAPA接头产品组合(图2),按照接头连接方式分为全长接头和截短接头。

 

 

全长接头

KAPA UDI Adapters是一种由P5/P7、96种双端Index以及R1 SP/R2 SP序列组成的全长接头,适用于PCR-free文库制备流程。

 

截短接头

截短接头仅包括R1 SP/R2 SP序列,P5/P7和Index序列需通过引物扩增连入接头。KAPA HyperPlex Adapters是一套完整的接头组合产品:

  • KAPA Universal Adapter截短型双端通用接头,适用于非低频突变检测

  • KAPA Universal UMI Adapter带有UMI(Unique Molecular Identifiers)的截短型双端通用接头,适用于低频突变检测

  • KAPA UDI Primer Mixes 1-384搭配两种KAPA通用短接头使用,实现达384种Index组合的高通量混样测序

 

 

 

接头攻略

 

双端标签设计,有效剔除标签

错配序列

  • 多重混样测序时,有时会发生接头标签序列错配的问题,进而导致测序数据质量的下降和结果可信度的降低。错配的风险主要由以下原因引发:

    1)测序仪工作时发生的标签跳跃/转换现象

    2)标签试剂或者样品间的交叉污染

    3)混合样品在PCR扩增时发生模板调换

    4)测序或数据分析错误

  • KAPA UDI接头双端标签组合在数据分析之前即可过滤掉因标签错配而产生的错误序列,从而提升变异识别准确性。

 

 

 

 

UMI标签设计,提高低频突变检测准确性

  • 低频突变检测在肿瘤研究,特别是液体活检研究方面至关重要,但在文库构建、靶向富集和测序过程中引入的突变会阻碍低频变异检测的准确性,UMI标签可以对原始样本进行分子标记,有利于后续在数据分析时对原始样本进行追踪和分组,从而对假阳性突变进行校正。

  • KAPA Universal UMI Adapter采用罗氏专有设计,可防止因UMI序列发生错误导致样本追踪错误,在性能上表现出高的双链回收率和低的错误率。

 
 

截短型KAPA HyperPlex接头可以获得

更高的文库产量

  • KAPA HyperPlex接头扩增效率高,文库转化率高,可以在较少的扩增循环数下得到较高的文库产量,其文库产量几乎是全长接头的两倍。

  • 满足实验所需文库产量的情况下,较少的扩增循环可以增加文库多样性并减少PCR重复序列。

 

 

 

高质量二代测序数据少不了接头助力,

接头怎么选你学会了吗?

 

MC-CN-02167 有效期至2025年5月18日。

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